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ELISA試劑盒細(xì)胞培養(yǎng)的操作步驟

2016-01-20 [1239]

原代分離細(xì)胞培養(yǎng)是指從供體內(nèi)取出組織后,經(jīng)機(jī)械以及消化分離成單個(gè)細(xì)胞或單一型細(xì)胞群,使之在體外模擬人體生理環(huán)境,在無菌、適當(dāng)溫度和一定的營養(yǎng)條件下,生存、生長和繁殖。原代培養(yǎng)細(xì)胞常有不同的細(xì)胞成分,生長緩慢,但是更能代表所來源的組織細(xì)胞類型和表達(dá)組織的特異性特征。利用原代細(xì)胞培養(yǎng)做各種實(shí)驗(yàn),ELISA試劑盒如藥物測試、細(xì)胞分化及病毒學(xué)方面的試驗(yàn)效果很好。其操作步驟如下。
1. 剪切組織 先將所取得的組織,用D-Hanks或Hanks液清洗,以去除表面血污,并用手術(shù)鑷去除黏附的結(jié)締組織等非培養(yǎng)所需組織。再次清洗后,用手術(shù)刀將組織切成若干小塊,移入青霉素小瓶或小燒杯中,加入適量緩沖液,用彎頭眼科剪,反復(fù)剪切組織,直到組織成糊狀,約1mm3大小。靜置片刻后,用吸管吸去上層液體,加入適當(dāng)?shù)木彌_液再清洗一次。
2. 消化分離 消化分離的目的是將細(xì)小的組織塊消化分離成細(xì)胞團(tuán)或分散的單個(gè)細(xì)胞,以利于進(jìn)一步的培養(yǎng),常用的消化酶有胰蛋白酶和膠原酶。
3. 培養(yǎng) 細(xì)胞懸液用計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。用培養(yǎng)液將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為(2~5)×105 cells/ml,或?qū)嶒?yàn)所需密度,分裝于培養(yǎng)瓶中,使細(xì)胞懸液的量以覆蓋后略高于培養(yǎng)瓶底部為宜。置CO2培養(yǎng)箱內(nèi),5%CO2,37℃靜置培養(yǎng)。一般3~5d,ELISA試劑盒原代培養(yǎng)細(xì)胞可以黏附于瓶壁,并伸展開始生長,可補(bǔ)加原培養(yǎng)液量1/2的新培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)2~3d后換液,一般7~14d可以長滿瓶壁,進(jìn)行傳代。
4. 注意事項(xiàng)
(1)無菌操作:細(xì)菌或霉菌污染是培養(yǎng)失敗的常見原因,必須加強(qiáng)各個(gè)環(huán)節(jié)的無菌操作觀念,以預(yù)防為主,一旦污染,一般很難消除。 
(2)培養(yǎng)液:所用的培養(yǎng)液必須滿足細(xì)胞生存和生長的必要條件。由于細(xì)胞來源的動(dòng)物種類、組織類型不同,對培養(yǎng)液的要求有一定的差異,必要時(shí)可用預(yù)實(shí)驗(yàn)的方法選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液。
(3)小牛血清:小牛血清對于維持培養(yǎng)細(xì)胞的生存和促進(jìn)細(xì)胞增殖起著關(guān)鍵性作用。可選擇多種不同批號的小牛血清進(jìn)行小樣分析。一旦確定某一廠家的某一批號小牛血清后,就保持應(yīng)用至ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)完成。
(4)膠原酶溶液:必須新鮮配制,貯存時(shí)間過長(即使是-20℃低溫保存),也將影響消化效力,導(dǎo)致消化時(shí)間過長,細(xì)胞損傷增加。
(5)L-谷氨酰胺:幾乎所有細(xì)胞對谷氨酰胺都有較高的要求,細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì),在缺少谷氨酰胺時(shí),細(xì)胞會(huì)因生長不良而死亡。谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定,加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4℃冰箱貯存兩周以上時(shí),就應(yīng)重新加入原來量的谷氨酰胺。
(6)靜置培養(yǎng):原代細(xì)胞在消化分離后,置于CO2培養(yǎng)箱的頭24~48h (必要時(shí)72h)內(nèi),應(yīng)處于靜置狀態(tài),切忌不時(shí)地取出培養(yǎng)瓶觀察生長狀況,這將使原代分離細(xì)胞難以貼壁,更談不上伸展和增殖,初學(xué)者尤應(yīng)注意。不必?fù)?dān)心培養(yǎng)液中的營養(yǎng)成分會(huì)消耗光,在細(xì)胞增殖之前對營養(yǎng)的要求并不大。原代培養(yǎng)初期僅加一薄層培養(yǎng)液的目的也在于有利于細(xì)胞貼壁伸展。
(7)消化時(shí)間:一般消化至肉眼尚可見微小組織顆粒即可,因?yàn)榇藭r(shí)組織顆粒已經(jīng)松散,略經(jīng)吹打即成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞,過久的消化往往導(dǎo)致細(xì)胞損傷加重,細(xì)胞培養(yǎng)成活率降低。
(8)其他生長因子:經(jīng)過以上處理,一般原代分離細(xì)胞培養(yǎng)均可以成功。對于少數(shù)特殊類型細(xì)胞也可以考慮加一些特殊的生長因子,如胰島素能促使細(xì)胞攝取葡萄糖和氨基酸。另外,內(nèi)毒素、EGF、FGF等均有促有絲分裂作用,但費(fèi)用較高。

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