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人 (Human) 雌激素 (Estrogen) ELISA 檢測試劑盒說明書

2014-04-01 [932]

人 (Human) 雌激素 (Estrogen) ELISA 檢測試劑盒說明書
本試劑僅供研究使用      標本:血清或血漿

試驗原理:
Estrogen試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA).已知Estrogen濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內(nèi)進行檢測。先將Estrogen和生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后,加入親和素標記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌,去除未結(jié)合的酶結(jié)合物,然后加入底物A、B,和酶結(jié)合物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中Estrogen的濃度呈比例關(guān)系。

試劑盒內(nèi)容及其配制
試劑盒成份(2-8℃保存)    96孔配置    48孔配置    配制
96/48人份酶標板    1塊板(96T)    半塊板(48T)    即用型
塑料膜板蓋    1塊    半塊    即用型
標準品:80ng/ml    1瓶(0.6ml)    1瓶(0.3ml)    按說明書進行稀稀
空白對照    1瓶(1.0ml)    1瓶(0.5ml)    即用型
標準品稀釋緩沖液    1瓶(5ml)    1瓶(2.5ml)    即用型
生物素標記的抗Estrogen抗體    1瓶(6ml)    1瓶(3.0ml)    即用型
親和鏈酶素-HRP    1瓶(10ml)    1瓶(5.0ml)    即用型
洗滌緩沖液    1瓶(20ml)    1瓶(10ml)    按說明書進行稀釋
底物A    1瓶(6.0ml)    1瓶(3.0ml)    即用型
底物B    1瓶(6.0ml)    1瓶(3.0ml)    即用型
終止液    1瓶(6.0ml)    1瓶(3.0ml)    即用型
標本稀釋液    1瓶(12ml)    1瓶(6.0ml)    即用型

自備材料
1.    蒸餾水。
2.    加樣器:5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。
3.    振蕩器及磁力攪拌器等。

安全性
1.    避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體,請盡快用水沖洗。
2.    實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
3.    不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

人 (Human) 雌激素 (Estrogen) ELISA 檢測試劑盒說明書操作注意事項
1.    試劑應(yīng)按標簽說明書儲存,使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標準品應(yīng)丟棄,不可保存。
2.    實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中,密封保存,以免變質(zhì)。
3.    不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
4.    使用一次性的吸頭以免交叉污染,吸取終止液和底物A、B液時,避免使用帶金屬部分的加樣器。
5.    使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6.    洗滌酶標板時應(yīng)充分拍干,不要將吸水紙直接放入酶標反應(yīng)孔中吸水。
7.    底物A應(yīng)揮發(fā),避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感,避免長時間暴露于光下。避免用手接觸,有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。
8.    加入試劑的順序應(yīng)一致,以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。
9.    按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

樣品收集、處理及保存方法
1、    血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后,1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2、    血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
3、    細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4、    組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘,取上清液
5、    保存------如果樣品不立即使用,應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存,避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒,檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

試劑的準備
1.    標準品:標準品的系列稀釋應(yīng)在實驗時準備,不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行:
80 ng/ml    (6號標準品)    原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。
40 ng/ml    (5號標準品)    100ul的原倍標準品加入100ul的標準品稀釋液
20 ng/ml    (4號標準品)    100ul的5號標準品加入100ul的標準品稀釋液
10 ng/ml    (3號標準品)    100ul的4號標準品加入100ul的標準品稀釋液
5.0 ng/ml    (2號標準品)    100ul的3號標準品加入100ul的標準品稀釋液
2.5 ng/ml    (1號標準品)    100ul的2號標準品加入100ul的標準品稀釋液
0 ng/ml    (空白對照)    原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

2.    洗滌緩沖液(50×)的稀釋:蒸餾水50倍稀釋。

人 (Human) 雌激素 (Estrogen) ELISA 檢測試劑盒說明書操作步驟
1.    使用前,將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫,以免加樣時加入大量的氣泡,產(chǎn)生加樣上的誤差。
2.    根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定,能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。標本用標本稀釋液1:1稀釋后加入50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。
3.    加入稀釋好后的標準品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板,輕輕振蕩混勻,37℃溫育1小時。
4.    甩去孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數(shù)增加一次。
5.    每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP,輕輕振蕩混勻,37℃溫育30分鐘。
6.    甩去孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數(shù)增加一次。
7.    每孔加入底物A、B各50ul,輕輕振蕩混勻,37℃溫育10分鐘。避免光照。
8.    取出酶標板,迅速加入50ul終止液,加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。
9.    在450nm波長處測定各孔的OD值。

建議使用的實驗方案
    標準品濃度(ng/ml)    
A    80    80    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品
B    40    40    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品
C    20    20    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品
D    10    10    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品
E    5.0    5.0    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品
F    2.5    2.5    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品
G    0    0    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品
H    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品    樣品

局限
6號標準品以上的結(jié)果為非線性的,根據(jù)此標準曲線無法得到的結(jié)果。

試劑盒性能
1. 靈敏度:zui小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。
2. 特異性:不與其它細胞因子反應(yīng)。
3. 重復(fù)性:板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。

結(jié) 果 判 斷 與 分 析
1、儀器值:于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值

2、以吸光度OD值為縱坐標(Y),相應(yīng)的Estrogen標準品濃度為橫坐標(X),做得相應(yīng)的曲線,樣品的Estrogen含量可根據(jù)其OD值由標準曲線換算出相應(yīng)的濃度。

3、檢測值范圍:0-80ng/ml

4、敏感度: 0.1 ng/ml

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