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人 (Human) 端粒酶 (telomerase) ELISA 檢測試劑盒說明書

2014-03-20 [811]

(Human) 端粒酶 (omerase) ELISA 檢測試劑盒說明書

omerase ELISA試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿、組織、緩沖液中細胞上清液及各種體液中的omerase 。本試劑盒可以檢測天然和重組的omerase 。本試劑盒于科研、而非用于臨床診斷。

 

試驗原理

omerase 試劑盒是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗(ELISA.已知omerase 濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。先將omerase 和生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后,加入親和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌,去除未結合的酶結合物,然后加入底物A、B,和酶結合物同時作用。產生顏色。顏色的深淺和樣品中omerase 的濃度呈比例關系。

 

試劑盒內容及其配制

試劑盒成份(2-8℃保存)

96孔配置

48孔配置

配制

96/48人份酶標板

1塊板(96T

半塊板(48T

即用型

塑料膜板蓋

1

半塊

即用型

標準品:40IU/ml

1瓶(0.6ml

1瓶(0.3ml

按說明書進行稀稀

空白對照

1瓶(1.0ml

1瓶(0.5ml

即用型

標準品稀釋緩沖液

1瓶(5ml

1瓶(2.5ml

即用型

生物素標記的抗omerase抗體

1瓶(6ml

1瓶(3.0ml

即用型

親和鏈酶素-HRP

1瓶(10ml

1瓶(5.0ml

即用型

洗滌緩沖液

1瓶(60ml

1瓶(30ml

按說明書進行稀釋

底物A

1瓶(6.0ml

1瓶(3.0ml

即用型

底物B

1瓶(6.0ml

1瓶(3.0ml

即用型

終止液

1瓶(6.0ml

1瓶(3.0ml

即用型

 

自備材料

  1. 蒸餾水。
  2. 加樣器:5ul、10 ul、50 ul、100 ul200、500 u1000lul
  3. 振蕩器及磁力攪拌器等。

 

安全性

  1. 此試劑盒的人血制品中的HbsAg、和抗HIV為陰性,但沒有實驗室可*保證此血制品不會傳染肝炎、AIDS或其它傳染病,依據當地的安全條例處理本試劑盒里的成份及血清和血漿等樣品。
  2. 避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體,請盡快用水沖洗。
  3. 實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
  4. 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

 

 

ELISA試劑盒操作注意事項

  1. 試劑應按標簽說明書儲存,使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄,不可保存。
  2. 實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中,密封保存,以免變質。
  3. 不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。
  4. 使用一次性的吸頭以免交叉污染,吸取終止液和底物A、B液時,避免使用帶金屬部分的加樣器。
  5. 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
  6. 洗滌酶標板時應充分拍干,不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。
  7. 底物A應揮發(fā),避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感,避免長時間暴露于光下。避免用手接觸,有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。
  8. 加入試劑的順序應一致,以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。
  9. 按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

 

樣品收集、處理及保存方法

  1. 血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內毒素的試管。收集血液后,1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
  2. 血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
  3. 細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
  4. 保存------如果樣品不立即使用,應將其分成小部分-70 ℃保存,避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒,檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

 

試劑的準備

  1. 標準品:標準品的系列稀釋應在實驗時準備,不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行:

40 IU/ml

6號標準品)

原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。

20 IU/ml

5號標準品)

100ul的原倍標準品加入100ul的標準品稀釋液

10 IU/ml

4號標準品)

100ul5號標準品加入100ul的標準品稀釋液

5.0 IU/ml

3號標準品)

100ul4號標準品加入100ul的標準品稀釋液

2.5 IU/ml

2號標準品)

100ul3號標準品加入100ul的標準品稀釋液

1.25 IU/ml

1號標準品)

100ul2號標準品加入100ul的標準品稀釋液

0 IU/ml

(空白對照)

原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

 

  1. 洗滌緩沖液(20×)的稀釋:蒸餾水20倍稀釋。

 

操作步驟

  1. 使用前,將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫,以免加樣時加入大量的氣泡,產生加樣上的誤差。
  2. 根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定,能使用復孔的盡量做復孔。
  3. 加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板,輕輕振蕩混勻,37℃溫育1小時。
  4. 甩去孔內液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復此操作四次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數增加一次。
  5. 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP,輕輕振蕩混勻,37℃溫育30分鐘。
  6. 甩去孔內液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復此操作四次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數增加一次。
  7. 每孔加入底物A、B50ul,輕輕振蕩混勻,37℃溫育15分鐘。避免光照。
  8. 取出酶標板,迅速加入50ul終止液,加入終止液后應立即測定結果。
  9. 450nm波長處測定各孔的OD值。

 

建議使用的實驗方案

 

標準品濃度(IU/ml

 

A

40

40

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

B

20

20

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

C

10

10

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

D

5.0

5.0

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

E

2.5

2.5

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

F

1.25

1.25

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

G

0

0

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

H

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

 

結果分析

以吸光度OD值為縱坐標(Y),相應的omerase 標準品濃度為橫坐標(X),做得相應的曲線,樣品的omerase 含量可根據其OD值由標準曲線換算出相應的濃度。

 

局限

6號標準品以上的結果為非線性的,根據此標準曲線無法得到的結果。

 

ELISA試劑盒性能

  1. 靈敏度:zui小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990。
  2. 特異性:不與人其它細胞因子反應。
  3. 重復性:板內、板間變異系數均小于10%。
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