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ELISA試劑盒蛋白質(zhì)純化與結(jié)晶的培養(yǎng)原理

2013-11-19 [785]

ELISA試劑盒獲得蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)的*個瓶頸,就是制備大量純化的蛋白質(zhì)(>10mg),其濃度通常在10mg/ml以上,并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行結(jié)晶條件的篩選。運(yùn)用重組基因的技術(shù),將特定基因以選殖(clone)的方式嵌入表現(xiàn)載體(expression
vector)內(nèi),此一載體通常具有易于調(diào)控的特性。之后再將帶有特定基因的載體送入可快速生長的菌體中,如大腸桿菌(Escherichia
coli),在菌體快速生長的同時,也大量生產(chǎn)表現(xiàn)載體上的基因所解譯出之蛋白質(zhì)。一般而言純度越高的蛋白質(zhì)比較有機(jī)會形成晶體,因此純化蛋白質(zhì)的步驟就成為一個重要的決定因素。
在取得高純度的蛋白質(zhì)溶液后,接下來就是晶體的培養(yǎng)。蛋白質(zhì)晶體與其他化合物晶體的形成類似,是在飽和溶液中慢慢產(chǎn)生的,每一種蛋白質(zhì)養(yǎng)晶的條件皆有所差異,影響晶體形成的變量很多,包含化學(xué)上的變量,如酸堿度、沉淀劑種類、離子濃度、蛋白質(zhì)濃度等;物理上的變數(shù),如溶液達(dá)成過飽和狀態(tài)的速率、溫度等;及生化上的變數(shù),如蛋白質(zhì)所需的金屬離子或抑制劑、蛋白質(zhì)的聚合狀態(tài)、等電點等,皆是養(yǎng)晶時的測試條件。截至目前為止,并無一套理論可以預(yù)測結(jié)晶的條件,ELISA試劑盒所以必須不斷測試各種養(yǎng)晶溶液的組合后,才可能得到一顆的單一晶體。
蛋白質(zhì)晶體的培養(yǎng),通常是利用氣相擴(kuò)散法(Vapor Diffusion
Method)的原理來達(dá)成;也就是將含有高濃度的蛋白質(zhì)(10~50mg/ml)溶液加入適當(dāng)?shù)娜軇?,慢慢降低蛋白質(zhì)的溶解度,使其接近自發(fā)性的沈淀狀態(tài)時,蛋白質(zhì)分子將在整齊的堆棧下形成晶體。舉例來說,我們將蛋白質(zhì)溶于低濃度(~1.0M)的硫酸銨溶液中,將它放置于一密閉含有高濃度(~2.0M)硫酸銨溶液的容器中,由氣相平衡,可以緩慢提高蛋白質(zhì)溶液中硫酸銨的濃度,進(jìn)而達(dá)成結(jié)晶的目的。
蛋白質(zhì)晶體在外觀上與其他晶體并無明顯不同之處,但在晶體的內(nèi)部,卻有很大的差異。一般而言,蛋白質(zhì)晶體除了蛋白質(zhì)分子外,其他的空間則充滿約40%至60%之間的水溶液,其液態(tài)的成分不僅使晶體易碎,也容易使蛋白質(zhì)分子在晶格排列上有不規(guī)則的情形出現(xiàn),造成晶體處理時的困難及繞射數(shù)據(jù)上的搜集不易等缺點。但也由于高含水量的特性,ELISA試劑盒讓蛋白質(zhì)分子在晶體內(nèi)與水溶液中的狀態(tài),極為相似。所以由晶體所解出的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),基本上可視為自然狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)。
 

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