兔（Rabbit）腫瘤壞死因子a（TNF-a）ELISA 檢測試劑盒
2010-04-19
[2107]
兔TNF-α ELISA試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿、組織、緩沖液中細(xì)胞上清液及各種體液中的TNF-α 。本試劑盒可以檢測天然和重組的TNF-α 。本試劑盒于科研、而非用于臨床診斷。
試驗原理：
兔TNF-α 試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）.已知TNF-α 濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進行檢測。先將TNF-α 和生物素標(biāo)記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標(biāo)記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A、B，和酶結(jié)合物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中TNF-α 的濃度呈比例關(guān)系。
試劑盒內(nèi)容及其配制
| 試劑盒成份（2-8℃保存） | 96孔配置 | 48孔配置 | 配制 |
| 96/48人份酶標(biāo)板 | 1塊板（96T） | 半塊板（48T） | 即用型 |
| 塑料膜板蓋 | 1塊 | 半塊 | 即用型 |
| 標(biāo)準(zhǔn)品：400pg/ml | 1瓶（0.6ml） | 1瓶（0.3ml） | 按說明書進行稀稀 |
| 空白對照 | 1瓶（1.0ml） | 1瓶（0.5ml） | 即用型 |
| 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液 | 1瓶（5ml） | 1瓶（2.5ml） | 即用型 |
| 生物素標(biāo)記的抗TNF-α抗體 | 1瓶（6ml） | 1瓶（3.0ml） | 即用型 |
| 親和鏈酶素-HRP | 1瓶（10ml） | 1瓶（5.0ml） | 即用型 |
| 洗滌緩沖液 | 1瓶（60ml） | 1瓶（30ml） | 按說明書進行稀釋 |
| 底物A | 1瓶（6.0ml） | 1瓶（3.0ml） | 即用型 |
| 底物B | 1瓶（6.0ml） | 1瓶（3.0ml） | 即用型 |
| 終止液 | 1瓶（6.0ml） | 1瓶（3.0ml） | 即用型 |
自備材料
1． 蒸餾水。
2． 加樣器：5ul、10 ul、50 ul、100 ul、200、500 u、1000lul。
3． 振蕩器及磁力攪拌器等。
安全性
1． 避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。
2． 實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
3． 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。
操作注意事項
1． 試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存。
2． 實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。
3． 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
4． 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。
5． 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6． 洗滌酶標(biāo)板時應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。
7． 底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。
8． 加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。
9． 按照說明書中標(biāo)明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。
樣品收集、處理及保存方法
1、 血清-----操作過程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2、 血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
3、 細(xì)胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4、 保存------如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
試劑的準(zhǔn)備
1． 標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實驗時準(zhǔn)備，不能儲存。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行：
| 400 pg/ml | （6號標(biāo)準(zhǔn)品） | 原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。 |
| 200 pg/ml | （5號標(biāo)準(zhǔn)品） | 100ul的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
| 100 pg/ml | （4號標(biāo)準(zhǔn)品） | 100ul的5號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
| 50 pg/ml | （3號標(biāo)準(zhǔn)品） | 100ul的4號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
| 25 pg/ml | （2號標(biāo)準(zhǔn)品） | 100ul的3號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
| 12.5 pg/ml | （1號標(biāo)準(zhǔn)品） | 100ul的2號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
| 0 pg/ml | （空白對照） | 原始濃度不用稀釋直接加入50ul。 |
2． 洗滌緩沖液（20×）的稀釋：蒸餾水20倍稀釋。
操作步驟
1． 使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。
2． 根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。
3． 加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時。
4． 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
5． 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
6． 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
7． 每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。
8． 取出酶標(biāo)板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。
9． 在450nm波長處測定各孔的OD值。
建議使用的實驗方案
| | 標(biāo)準(zhǔn)品濃度（pg/ml） | | ||||||||||
| A | 400 | 400 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 |
| B | 200 | 200 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 |
| C | 100 | 100 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 |
| D | 50 | 50 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 |
| E | 25 | 25 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 |
| F | 12.5 | 12.5 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 |
| G | 0 | 0 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 |
| H | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 |
結(jié)果分析
以吸光度OD值為縱坐標(biāo)（Y），相應(yīng)的TNF-α 標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X），做得相應(yīng)的曲線，樣品的TNF-α 含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。
局限
6號標(biāo)準(zhǔn)品以上的結(jié)果為非線性的，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線無法得到的結(jié)果。
試劑盒性能
1． 靈敏度：zui小的檢測濃度小于1號標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。
2． 特異性：不與人其它細(xì)胞因子反應(yīng)。
3． 重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。
