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分子信標(biāo)的發(fā)展

2010-04-08 [2068]

分子信標(biāo)是一種設(shè)計(jì)巧妙的熒光探針。在長度為15-30mer寡核昔酸探針的兩端分別加上5-8mer序列互補(bǔ)的莖桿區(qū)。在自由狀態(tài)時(shí)由于莖桿區(qū)互補(bǔ)序列的結(jié)合使探針分子形成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu),所以又被稱為發(fā)夾探針。探針的5'端及3'端分別聯(lián)用熒光素分子及碎滅劑分子。為經(jīng)典的分子信標(biāo)結(jié)構(gòu),其中1-氨基蔡-8-叛酸(EDANS)為熒光素,二甲氨基偶氮苯甲酚(DABSYI.)為猝滅劑。自由狀態(tài)時(shí),發(fā)夾結(jié)構(gòu)的兩個(gè)末端靠近,使熒光分子與碎滅分子靠近(約為7-1Onm)。此時(shí)發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移,使熒光分子發(fā)出的熒光被碎滅分子吸收并以熱的形式散發(fā),熒光幾乎*被猝滅,熒光本底極低。為分子信標(biāo)的工作原理,當(dāng)分子信標(biāo)與序列*互補(bǔ)的靶標(biāo)分子結(jié)合形成雙鏈雜交體時(shí),信標(biāo)莖桿互補(bǔ)區(qū)被拉開,熒光分子和碎滅分子距離增大。根據(jù)Foerster理論,中心熒光能量轉(zhuǎn)移效率與兩者距離的6次方成反比。雜交后,信標(biāo)分子的熒光幾乎100%恢復(fù)。且所檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度與溶液中靶標(biāo)的量成正比。

  分子信標(biāo)中zui常用的猝滅劑是DABSYL,它對(duì)多種熒光素都有較強(qiáng)的熒光猝滅效率。近來Dubertret等用金納米粒子簇代替DABSYL做猝滅劑,人們還可以通過調(diào)節(jié)金屬納米簇的形狀、大小和組成而得到不同的猝滅劑。由于金納米簇對(duì)熒光試劑有著更高的猝滅效率,所以用金納米粒子代替DABSYL后,大大提高了分子信標(biāo)的靈敏度和特異性

  分子信標(biāo)這一熒光信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制是基于熒光能量轉(zhuǎn)移基礎(chǔ)上的??赡苡袃煞N能量轉(zhuǎn)移的形式存在:直接的能量轉(zhuǎn)移和熒光共振能量轉(zhuǎn)移。當(dāng)熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)距離很近時(shí),由于兩個(gè)基團(tuán)分子相互碰撞可產(chǎn)生直接的能量轉(zhuǎn)移。當(dāng)兩個(gè)基團(tuán)的距離在且能量給體(熒光基團(tuán))的發(fā)射光譜與能量受體(猝滅基團(tuán))的吸收光譜有較大程度的重疊時(shí),則可發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移。由于已發(fā)現(xiàn)(二甲基胺基苯基)偶氮苯甲酸可作為分子信標(biāo)通用的猝滅基團(tuán),它對(duì)多種發(fā)射光譜不同的熒光基團(tuán)都有很好的猝滅作用。因此,直接的能量轉(zhuǎn)移可能是一種主要的熒光能量轉(zhuǎn)移機(jī)制。

  分子信標(biāo)zui初被用作聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的熒光探針,分子信標(biāo)工作原理,它既可以對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測(cè),又可以對(duì)擴(kuò)增的過程進(jìn)行實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)zui近國內(nèi)孔德明等設(shè)計(jì)出了TagMan分子信標(biāo),也是一種性能良好的PCR熒光探針。

  Tyagi等在發(fā)明了傳統(tǒng)的分子信標(biāo)后,又設(shè)計(jì)了一種熒光波長轉(zhuǎn)移型分子信標(biāo),即在分子信標(biāo)的一末端連接兩個(gè)不同的熒光基團(tuán):熒光收集基團(tuán)和熒光發(fā)射基團(tuán),分子信標(biāo)的另一末端連接猝滅基團(tuán)。未結(jié)合靶分子時(shí),它與傳統(tǒng)的分子信標(biāo)一樣,熒光收集基團(tuán)吸收的能量傳給猝滅基團(tuán),以熱的形式放出,不產(chǎn)生熒光;當(dāng)與靶分子結(jié)合發(fā)生構(gòu)象變化后,熒光收集基團(tuán)的熒光并未恢復(fù),而是把能量以熒光共振能

  量轉(zhuǎn)移的形式轉(zhuǎn)移給熒光發(fā)射基團(tuán),熒光發(fā)射基團(tuán)將能量以熒光的形式放出。這樣可以通過選擇不同波長的熒光發(fā)射基團(tuán),從而使分子信標(biāo)按設(shè)計(jì)的要求發(fā)出不同顏色的熒光。同時(shí),這種新型的分子信標(biāo)具有較大的斯托克位移,解決了傳統(tǒng)分子信標(biāo)中激發(fā)波長和發(fā)射波長差別較小,從而使一部分激發(fā)光通過反射和散射到達(dá)檢測(cè)器,影響靈敏度的問題。

  TagMan分子信標(biāo)仍然保留了經(jīng)典分子信標(biāo)的莖一環(huán)結(jié)構(gòu),不同的是,TagMan分子信標(biāo)除環(huán)部序列外,其5'一端莖序列也被設(shè)計(jì)為探針的基因識(shí)別部位。當(dāng)探針與靶標(biāo)序列發(fā)生特異互補(bǔ)雜交形成雙鏈時(shí),Taq酶的5'—3'外切活性即被激活,將探針5' 端連接的熒光分子從探針上切割下來,從而使熒光分子與碎滅分子*分開,熒光恢復(fù)。TagMan分子信標(biāo)集中了TagMan探針和分子信標(biāo)兩種探針技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),在雜交和探針降解過程中TagMan分子信標(biāo)均能產(chǎn)生熒光信號(hào),這使得TagMan探針具有更高的靈敏度。

  根據(jù)分子信標(biāo)原理,NobukoHamaguchi等人設(shè)計(jì)了Aptamer信標(biāo)用于直接檢測(cè)蛋白質(zhì)。他們將抗凝血酶適體(Aptamer)的5'端連上一段ssDNA,使之與適體的3'端部分序列互補(bǔ),形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。自由狀態(tài)時(shí),熒光分子與碎滅分子靠近,熒光被*碎滅。當(dāng)凝血酶存在時(shí),適體會(huì)折疊成一定的構(gòu)象,通過三維結(jié)構(gòu)與凝血酶發(fā)生特異性結(jié)合。這樣Aptamer信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)被破壞,熒光分子與猝滅分子分開,熒光恢復(fù)。通過改變Aptamer信標(biāo)的組成或莖桿區(qū)的長度,Aptamer信標(biāo)可以用于不同種蛋白質(zhì)的測(cè)定。與酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定蛋白質(zhì)相比,Aptamer信標(biāo)技術(shù)具有簡(jiǎn)單、直接、靈敏、省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)。人們還可以將多種Aptamer信標(biāo)固定在芯片上,用于單一蛋白質(zhì)的檢測(cè)和分析。Aptamer信標(biāo)技術(shù)的缺點(diǎn)是不能用于檢測(cè)非特異性ssDNA結(jié)合蛋白,而且信標(biāo)的構(gòu)象受金屬離子影響很大,一些金屬離子的存在會(huì)干擾熒光信號(hào)的觀測(cè),特殊的發(fā)夾結(jié)構(gòu)使分子信標(biāo)具有很強(qiáng)的特異性識(shí)別靶標(biāo)序列的能力,目前已成為分子生物學(xué)和生物技術(shù)中一種強(qiáng)有力的研究工具。

  近年來,分子信標(biāo)技術(shù)得以飛速發(fā)展,已滲透到結(jié)構(gòu)和分子生物學(xué)、基因和生物技術(shù)等領(lǐng)域的各個(gè)方面。毫無疑問的是分子信標(biāo)技術(shù)有著廣闊的應(yīng)用空間。Chance等人已合成了一種可以診斷乳腺癌的分子信標(biāo),這預(yù)示著分子信標(biāo)技術(shù)將會(huì)給癌癥等疾病的診斷和治療帶來重大突破??梢灾苯佑糜跈z測(cè)非擴(kuò)增靶標(biāo)序列的分子信標(biāo)技術(shù)已經(jīng)出現(xiàn),并倍受人們的關(guān)注,但提高檢測(cè)靈敏度仍是這項(xiàng)技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵,隨著微量檢測(cè)技術(shù)和光譜技術(shù)的發(fā)展以及核酸酶、無機(jī)納米粒子用于分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì),各種新型分子信標(biāo)的出現(xiàn),使分子信標(biāo)靈敏度的進(jìn)一步提高成為了可能。另外,分子信標(biāo)還會(huì)在研究小分子一DNA的相互作用、蛋白質(zhì)一DNA的相互作以及生物傳感器的研制等領(lǐng)域里繼續(xù)發(fā)揮著自己的優(yōu)勢(shì)。

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