酶標記抗體法標記抗體的制備
酶標記抗體法標記抗體的制備
酶標記抗體法(enzaymelabelledantibodytechnique)是用結(jié)合物將酶結(jié)合在抗體分子上,制備成酶標記抗體,通過抗原—抗體反應(yīng)使抗原—抗體復(fù)合物上帶有酶分子,再借助酶對底物的特異性催化作用,在抗原—抗體反應(yīng)部位形成不溶性有色產(chǎn)物,用于研究抗原物質(zhì)分布和性質(zhì)。酶標記抗體法又分為直接法和間接法, 目前應(yīng)用zui多的酶是辣根過氧化酶(HRP),底物是3,3’—二氨基聯(lián)苯胺(DAB)。
抗體蛋白分子與酶分子(如HRP或AKP)以一定的方式相互交換,形成酶標記抗體,故稱酶標抗體或酶聯(lián)抗體,它是IHC酶標記抗體法的主要試劑,其質(zhì)量好壞將直接影響到方法的敏感性和特異性。HRP可以以共價鍵或非共價鍵方式黏附在其他的蛋白質(zhì)分子上,常見的標記方法有戊二醛一步法和二步法,也可以用過碘酸鈉氧化法,它們主要為共價鍵結(jié)合方式(反應(yīng)式見圖4—2和圖4—3);
另一種非共價鍵結(jié)合方式是用4,4’—二氟—3,3,—二硝基苯基砜(4,4/—difluoro-3,3,—dinitrophenylsulfone,F(xiàn)NPS)作為交聯(lián)試劑,該方法不常用。戊二醛二步法的標記效率要高于一步法,過碘酸鈉氧化法要高于戊二醛二步法。其主要原理是二種蛋白質(zhì)分子的賴氨酸上的e基團和含氨基的N端經(jīng)活化劑活化而結(jié)合。由于抗體和酶分子上所具有的反應(yīng)基團很少,需通過功能基團(如戊二醛)將更多的抗體和酶分子結(jié)合在一起,酶分子首先和雙功能試劑結(jié)合,再與抗體分子結(jié)合。這樣可以結(jié)合更多的酶和抗體,而且無聚合物產(chǎn)生。HRP還可以與生物素和親和素結(jié)合。
酶標記抗體法標記抗體的制備