哺乳動物細胞的RNAi技術(shù)策略
哺乳動物細胞的RNAi技術(shù)策略
目前RNAi技術(shù)已經(jīng)進入了生物科學研究的許多領(lǐng)域,成為了一種主要的生物學研究工具,發(fā)展得相當迅速,并受到了此次諾貝爾獎評審委員會的青睞,獲得2006年諾貝爾獎醫(yī)學/生理獎。然而這一才歷經(jīng)十個年頭的技術(shù)依然對于許多研究人員來說還是很陌生的,以下是有關(guān)RNAi技術(shù)在哺乳動物細胞中應(yīng)用的具體設(shè)計策略,主要來自于《遺傳》雜志2005年“RNA干涉(RNAi)技術(shù)應(yīng)用于哺乳動物細胞的研究策略”,希望能給從事或者準備從事RNAi相關(guān)實驗的研究人員以幫助。
哺乳動物細胞的RNAi技術(shù)策略
一、靶siRNA序列選擇
靶siRNAA序列選擇是RNAi實驗成敗的關(guān)鍵。哺乳動物細胞RNAi實驗中,使用zui廣泛且zui有效的是21bp siRNA。siRNA由正義鏈和反義鏈組成,兩條鏈3’端均有2個堿基突出,一般為UU或dTdT,其中正義鏈的前19nt與靶基因序列相同。
1. siRNA設(shè)計的原則
SiRNA雙鏈設(shè)計時,一般在靶mRNA起始密碼下游100—200bp至翻譯終止密碼上游d0—100bp的范圍內(nèi)搜尋AA序列,并記錄每個AA3’端相鄰19個核苷酸作為候選si.RNA靶位點。其中AA(N19)TT是的序列,若靶mRNA中無此序列,亦可選用NA(N21)或NAR(N17)YNN(R表示嘌呤,Y表示嘧啶),但在合成時,siRNA的正義鏈3’端需用dT—dT代替。TuscRl等建議設(shè)計的siRNA不要針對mRNA的5’和3’端非編碼區(qū),因為這些區(qū)域有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合位點,而UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響siRNP(siRNA protein complex,核酸內(nèi)切酶復合物)結(jié)合mRNA,從而影響siRNA干擾的效果。zui后還應(yīng)將候選siRNA序列在GenBank進行BLAST檢索,與非同源基因具有3個或哺乳動物細胞的RNAi技術(shù)策略
3個以上堿基相異的序列方可選用。
2. siRNA的序列結(jié)構(gòu)特征
除了靶序列位點的選擇,siIRNA序列本身結(jié)構(gòu)特征亦會影響到RNAi效率。RNAi實質(zhì)上可視為一個RNA與蛋白質(zhì)互作過程,包括siRNA與RISC結(jié)合、RISC的激活以及RISC與靶mRNA的結(jié)合和切割,這種互作效應(yīng)的存在,往往造成siRNA鏈的選擇具有偏愛性。Reynolds等通過對2個基因的180條siRNA序列分析,歸納出以下8個與siRNA性相關(guān)的特征:G/C含量低(30%-52%),正義鏈3’端具較低穩(wěn)定性(有利于siRNA與RISC的結(jié)合和解鏈),無反向重復序列(有利于減小siRNA的有效作用濃度,提高siRNA干擾效率),正義鏈堿基的偏愛性A19(正義鏈中第19位堿基為A,如下表示類同);A3;U10;無G/C(正義鏈中第19位堿基不為G或C);無G13。依此規(guī)則,Reynolds等設(shè)計的30條siRNA中有29條是有效的。Kumiko等亦認為siRNA反義鏈5’端為A/U(即有義鏈U/A)19和zui后7個堿基中有5個A/U,會有助于RNAi的發(fā)揮,且正義鏈G/C1和序列中無連續(xù)9nt以上的GC重復片段與基因沉默效率呈顯著相關(guān)。有趣的是,該實驗還表明這些規(guī)則同樣適用于DNA介導的RNAi(DNA-based RNAi.)實驗。此外,Amarzguioui等發(fā)現(xiàn)正義鏈5’與3’端的前3個堿基中A/U含量不對稱(3’端含量應(yīng)高一些)和A6對siRNA 的活性亦影響很大。根據(jù)上述結(jié)果,可以初步繪制出一個siRNA序列結(jié)構(gòu)的精細與簡略示意圖。
現(xiàn)已知道siRNA的反義鏈決定著靶位點識別,那么在不影響siRNA作用功效的前提下,是否可以對其正義鏈堿基作適當更改或修飾呢?Amarzguioui等研究siRNA不同部位對堿基突變和化學修飾的耐受性,認為siRNA的5’端相對于3’端具有對突變的較高耐受性。有學者認為正義鏈3’突出端的任何堿基修飾對siRNA作用效果均無明顯影響。還有學者認為與反義鏈互補的正義鏈3’端發(fā)生1—4個堿基的錯配反而有助于增強RNAI的活性。
二、siRNA制備方法
目前為止較為常用的5種制備siRNAs的方法包括
化學合成
體外轉(zhuǎn)錄
長片斷dsRNAs經(jīng)RNase III 類降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)
siRNA表達載體或者病毒載體在細胞中表達siRNAs
PCR制備的siRNA表達框在細胞中表達
前面3種方法包括體外制備siRNAs然后經(jīng)過轉(zhuǎn)染或者電轉(zhuǎn)導入哺乳動物細胞后面兩種方法則依賴能夠表達siRNAs的DNA載體或者表達框轉(zhuǎn)染到細胞中。每種方法都有自己的優(yōu)點和缺點。哪種是的方法,其實取決于實驗目的。這里簡單介紹這5種方法,優(yōu)點和缺點,以及它們的應(yīng)用。
siRNA的設(shè)計
除了方法3以外,其他的方法都在制備siRNA 前都需要單獨設(shè)計siRNA序列。關(guān)于怎樣設(shè)計siRNA以及siRNA設(shè)計對siRNA功能的影響,盡管我們不斷掌握越來越多有關(guān)設(shè)計原則的信息。但這仍然不是的。通常來說,每個目標序列設(shè)計3—4對siRNAs,在后面的實驗中選擇zui有?的那個。網(wǎng)上有提供免費的siRNA設(shè)計工具。
體外制備
1.化學合成
盡管化學合