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ELISA法檢測(cè)干擾素

2011-10-20 [1429]

ELISA法檢測(cè)干擾素

干擾素(IFN)是一類具有廣譜抗病毒活性的蛋白質(zhì),僅在同種細(xì)胞上發(fā)揮作用。根據(jù)其來(lái)源、理化及生物學(xué)性質(zhì)的不同,可分為IFN-α、IFN-β、IFN-γ3種干擾素。其中,IFN-α主要由白細(xì)胞產(chǎn)生,IFN-β由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生,IFN-γ主要由T細(xì)胞在免疫應(yīng)答中受到抗原或絲裂原活化后分泌產(chǎn)生。3種干擾素中,IFN-α、IFN-β抗病毒作用較強(qiáng),IFN-丁免疫調(diào)節(jié)作用較強(qiáng)。目前已可用基因重組技術(shù)制備干擾素投入臨床使用。干擾素不能直接滅活病毒,其抗病毒作用是由于它能激活細(xì)胞內(nèi)抗病毒蛋白基因,制造抗病毒蛋白,抑制病毒在體內(nèi)復(fù)制。干擾素不僅可抑制已感染細(xì)胞內(nèi)病毒的復(fù)制,而且還可使未感染細(xì)胞處于抗病毒狀態(tài),對(duì)中斷病毒的細(xì)胞間傳播有一定作用;但對(duì)病毒整合基因可能僅有暫時(shí)抑制其mRNA的轉(zhuǎn)錄作用,不能清除病毒基因。干擾素的免疫調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)為它是重要的巨噬細(xì)胞活化因子(macro-phageactivating factor,MAF),活化的巨噬細(xì)胞能殺死病原微生物或殺傷腫瘤細(xì)胞。干擾素能增強(qiáng)各種細(xì)胞表達(dá)MAF分子從而有利于遞呈抗原或利于T細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的識(shí)別和殺傷;還能促進(jìn)T、B細(xì)胞的分化,活化NK細(xì)胞和中性粒細(xì)胞,從而有助于加強(qiáng)免疫應(yīng)答。由于干擾素不是一種淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)因子,故常抑制淋巴細(xì)胞(特別是B細(xì)胞)的增殖。
IFN抗病毒活性的特點(diǎn)如下:①僅僅是抑制作用,IFN消失后病毒將重新復(fù)制,因此必須足量反復(fù)應(yīng)用;②有相對(duì)的種屬特異性,IFN-γ較IFN-α、IFN-β嚴(yán)格;③IFN不直接滅活病毒,而是通過(guò)細(xì)胞基因組產(chǎn)生另一些蛋白因子來(lái)發(fā)揮效能,因此不同細(xì)胞對(duì)IFN的敏感性不同;④不同感染狀態(tài)的病毒-細(xì)胞系統(tǒng)對(duì)IFN的敏感性不同,病毒大量復(fù)制、引起細(xì)胞炎癥應(yīng)答時(shí),IFN易產(chǎn)生效應(yīng);對(duì)完整細(xì)胞中的整合型病毒無(wú)作用。
[檢測(cè)方法] ELISA法
[方法學(xué)原理] 抗人IFN抗體包被在微孔反應(yīng)板上,待測(cè)標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品中的IFN會(huì)與抗人IFN抗體結(jié)合,游離的成分被洗去,同時(shí)加入生物素化的抗人IFN抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素。生物素與親和素特異結(jié)合,抗人IFN抗體與結(jié)合在單克隆抗體上的人IFN結(jié)合而形成免疫復(fù)合物,游離的成分被洗去。加入顯色劑,若反應(yīng)孔中有IFN,HRP會(huì)使五色的顯色劑呈現(xiàn)藍(lán)色,加終止液變。在波長(zhǎng)450nm處測(cè)吸光度,IFN濃度與吸光度成正比,可通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中的IFN濃度。
[標(biāo)本準(zhǔn)備] 靜脈血2ml,不抗凝。
[試劑)
1.預(yù)包被微孔反應(yīng)板
2.濃縮酶結(jié)合物
3.酶結(jié)合物稀釋液
4.標(biāo)準(zhǔn)晶和標(biāo)本稀釋液
5.濃縮生物素化抗體
6.TFN標(biāo)準(zhǔn)品
7.濃縮洗滌液
8.顯色劑A、B
9.終止液
[儀器] 酶標(biāo)儀或全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀。
[檢測(cè)步驟]
1.在微孔反應(yīng)板相應(yīng)孔中分別加入待測(cè)樣本、不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品100ul,再加生物素化抗體工作液50ul。
2.振蕩混勻,置20~25℃環(huán)境中溫育120min。
3.將孔內(nèi)液體吸干,用洗滌液充分洗滌5次,干燥。
4.除空白孔外,加入酶結(jié)合物工作液100u1。
5.振蕩混勻,置20~25℃環(huán)境中溫育30min。
6.將孔內(nèi)液體吸干,用洗滌液充分洗滌5次,干燥。
7.每孔加入顯色劑A、B各50ul,輕輕振蕩混勻,37℃環(huán)境中避光顯色10min。
8.加入終止液50gl后,輕輕振蕩混勻。用酶標(biāo)儀(450nm波長(zhǎng))測(cè)定各孔吸光度,與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照,求出IFN值。
[正常參考值] 各實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)檢測(cè)方法的不同確立正常參考值。
[注意事項(xiàng)]
1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出時(shí)應(yīng)在室溫環(huán)境中平衡30min后方可使用,來(lái)用完的微孔條用自封袋密封保存。
2.酶標(biāo)板洗滌時(shí)各孔均需加滿洗滌液,防止孔內(nèi)有游離酶不能洗凈。應(yīng)設(shè)定30-60s的洗滌浸泡時(shí)間。
3。滴加試劑前應(yīng)將滴瓶翻轉(zhuǎn)數(shù)次,使液體混勻。滴加時(shí)瓶身應(yīng)保持垂直,以使滴量準(zhǔn)確。
4.所有樣品和廢棄物都應(yīng)按傳染源處理。終止液為2mol/L硫酸,使用時(shí)應(yīng)注意安全
5.每批樣本應(yīng)同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
6.檢測(cè)劑工作液按說(shuō)明書(shū)臨用前配置。
7.若標(biāo)本OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定范圍以外,應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)。
[臨床意義] IFN水平的改變主要見(jiàn)于自身免疫性疾病;在感染性疾病中,升高見(jiàn)于急性病毒感染,降低見(jiàn)于乙型肝炎病毒攜帶者、其他慢性病毒性肝炎及AIDS患者。
 

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