研域(上海)教您細胞是怎么轉染的
轉染 ,是將外源性基因導入細胞內的一種專門技術。跟著基因與蛋白功用研討的深化,轉染現(xiàn)在已成為試驗室工作中常常觸及的底子方法。轉染大致可分為物理介導、化學介導和生物介導三類途徑。電穿孔法、顯微打針和基因槍歸于通過物理方法將基因導入細胞的*;化學介導方法許多,如經典的磷酸鈣共沉淀法、脂質體轉染方法、和多種陽離子物質介導的技術;生物介導方法,有較為原始的原生質體轉染,和現(xiàn)在比較多見的各種病毒介導的轉染技術。
志向細胞轉染方法,應該具有轉染功率高、細胞毒性小等長處。病毒介導的轉染技術,是現(xiàn)在轉染功率的方法,同時具有細胞毒性很低的優(yōu)勢。但是,病毒轉染方法的預備程序雜亂,常常對細胞類型有很強的選擇性,在一般試驗室中很難廣泛。其它物理和化學介導的轉染方法,則各有其特色。
需求指出的一點,不管選用哪種轉染技術,要取得*優(yōu)的轉染效果,或許都需求對轉染條件進行優(yōu)化。影響轉染功率的要素許多,從細胞類型、細胞培養(yǎng)條件和細胞生長情況,到轉染方法的操作細節(jié),都需求考慮。
一、細胞傳代
1. 試驗預備:200ul/1mlTip頭各一盒(以上物品均需高壓滅菌),酒精棉球,廢液缸,試管架,微量移液器,記號筆,培養(yǎng)皿,離心管。
2. 棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基,用1ml的PBS溶液洗刷兩次。
3. 用Tip頭參與1ml Trypsin液,消化1分鐘(37℃,5%CO2 )。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁,查詢到細胞*從壁上脫落下來中止。
4. 參與1ml的含血清培養(yǎng)基中止反應。
5. 用Tip頭屢次吹吸,使細胞*分散開。
6. 將培養(yǎng)液裝入離心管中,1000rpm離心5min。
7. 用培養(yǎng)液重懸細胞,細胞計數(shù)后選擇0.8X106個細胞參與一個35mm培養(yǎng)皿。
8. 將適合體積*培養(yǎng)液參與離心管中,混勻細胞后悄然參與培養(yǎng)皿中,使其均勻分布。
9. 將培養(yǎng)皿轉入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),第二天轉染。
二、細胞轉染
1. 轉染試劑的預備
① 將400ul去核酸酶水參與管中,轟動10秒鐘,溶解脂狀物。
② 轟動后將試劑放在-20攝氏度保存,運用前還需轟動。
2. 選擇適合的混合比例(1:1-1:2/脂質體體積:DNA質量)來轉染細胞。在一個轉染管中參與適合體積的無血清培養(yǎng)基。參與適合質量的MyoD或許EGFP的DNA,轟動后在參與適合體積的轉染試劑,再次轟動。
3. 將混合液在室溫放置10―15分鐘。
4. 吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基,用PBS或許無血清培養(yǎng)基清洗一次。
5. 參與混合液,將細胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時。
6. 屆時后,根據(jù)細胞品種決議是否移除混合液,之后參與*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時。
三、第2次細胞傳代
1. 在轉染后24小時,查詢試驗效果并記載綠色熒光蛋白表達情況。
2. 再次進行細胞傳代,按照免疫染色適合的密度0.8X105個細胞/35mm培養(yǎng)皿將細胞從頭轉入培養(yǎng)皿中。
3. 在正常條件下培養(yǎng)24小時后按照染色要求條件固定。
- 上一篇:如何保存ELISA試劑盒更安全
- 下一篇:研域(上海)化學來幫您想做理想的實驗