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ELISA試劑盒在實驗中的留心事項

2018-03-27 [1286]

在ELISA試劑盒實驗中的留意事項分為兩個關鍵:
一、做好對照
正式實驗時,應別離以陽性對照與陰性對照操控實驗條件,待檢樣品應作一式二份,以確保實驗成果的性。有時本底較高,闡明有非特異性反響,可選用羊血清、兔血清或BSA等關閉。
二、實驗條件的挑選
在ELISA中,進行各項實驗條件的挑選是很重要的,其間包括:
(1) 固相載體的挑選:很多物質(zhì)可作為固相載體,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其方式可所以凹孔平板、試管、珠粒等?,F(xiàn)在常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不論何種載體,在運用前均可進行篩選:用等量抗原包被,在同一實驗條件下進行反響,調(diào)查其顯色反響是不是均一性,據(jù)此判明其吸附功能是不是杰出。
(2) 包被抗體(或抗原)的挑選:將抗體(或抗原)吸附在固相載體外表時,請求純度要好,吸附時一般請求PH在9.0~9.6之間。吸附溫度,時刻及其蛋白量也有必定影響,一般多選用4℃ 18~24小時。蛋白質(zhì)包被的*適濃度需進行滴定:即用不一樣的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0和10μg/ml等)進行包被后,在其它實驗條件相一起,調(diào)查陽性標本的OD值。挑選OD值而蛋白量起碼的濃度。關于大都蛋白質(zhì)來說一般為1~10μg/ml。
(3) 酶的底物及供氫體的挑選:對供氫體的挑選請求是價廉、安全、有明顯地顯色反響,而自身無色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌效果,應留意防護。有條件者應運用不致癌、靈敏度高的供氫體,如TMB和ABTS是現(xiàn)在較為滿足的供氫體。底物效果一段時刻后,應參加強酸或強堿以停止反響。一般底物效果時刻,以10-30分鐘為宜。底物運用液必須新鮮配制,尤其是H2O2在臨用前參加。(4) 酶符號抗體作業(yè)濃度的挑選:首先用直接ELISA法進行開始效價的滴定(見酶符號抗體部份)。然后再固定其它條件或采納“方陣法”(包被物、待檢樣品的參考品及酶符號抗體別離為不一樣的稀釋度)在正式實驗體系里地滴定其作業(yè)濃度。
 

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